Беттік әдіспен өсірілген микроорганизмдер дақылдарынан ферменттік препараттарды алу кезінде тазарту процесі ферменттерді сумен экстракциялаудан басталады. Ерімейтін тұнбаны кептіреді және құрғақ биошрот түрінде мал азығына кәдеге жаратады.

Құрамында 7-14% құрғақ заты бар сығынды одан құрғақ препараттарды алған кезде қосымша концентрациялауды қажет етпейді және сондықтан техникалық препаратты алу мақсатында бүріккіш кептіруге бірден жіберілуі мүмкін немесе сығынды салқындатқышқа, содан кейін органикалық еріткіштермен немесе тұз ерітінділерімен тұндыру үшін жіберіледі. Сығындыдан құрамында 50% құрғақ заты бар тұрақты сұйық концентратты алуға болады, ол үшін сығынды жинаққа, содан кейін қыздырғышқа және вакуум-булау қондырғысына жібереді. Дайын сұйық концентратты арнайы ыдыстарға салып, дайын өнім қоймасына жібереді. Терең дақылдардан сұйық концентраттарды алуға болады, мысалы, ультрафильтрация әдісімен.

Кристалды және гомогенді препараттарға дейін тазартудың әртүрлі дәрежесіндегі ферментті препараттарды алудың көптеген схемалары бар. Әлемнің әртүрлі елдерінде жасалған мұндай схемалар көп жағдайда өте күрделі және технологиялық тәсілдердің әртүрлі комбинацияларын біріктіреді. Сондықтан қандай да бір жалпы ұсынымдар беру өте қиын, және әрбір нақты жағдайда осы продуцент дақылынан ферментті бөлудің барлық сатыларында тынымсыз зерттеулер жүргізу қажет. Тек осындай жұмыстың нәтижесінде ғана осы ферментке, микроорганизмдердің осы өсіріндісіне және осы ортаға әділ болатын практикалық ұсыныстарға келуге болады.Микробтан шыққан ферменттік препараттарды өндіру беттік және тереңдік әдістермен жүзеге асырылуы мүмкін.

Беттік әдіс кюветтерде орналасқан ылғалданған стерилденген сусымалы қоректік ортаның бетінде микроорганизмдерді өсіру болып табылады. Микроорганизмдерді инкубациялау арнайы термостатталатын цехта температураны, ылғалдылықты және ауа шығынын тұрақты бақылау кезінде жүргізіледі. Ферменттерді алудың беттік тәсілінің негізгі параметрлері слайдта келтірілген.

Ферменттердің продуценттерін тереңдік әдіспен өсіру үшін өнеркәсіптік жағдайларда стерильді ауаны сұйық қоректік ортаға беруге және араластыруға арналған құрылғылармен жабдықталған тот баспайтын болаттан жасалған ферментаторлар қолданылады.

Үдерісті жүргізудің тереңдік тәсілі беттік өсіру алдында бірқатар маңызды артықшылықтарға ие, өйткені үдерісті айтарлықтай автоматтандыруға, бірқатар жағдайларда қалдықтар көлемін едәуір қысқартуға, процесті үздіксіз жүргізуге, цех алаңдарын 2-3 есеге қысқартуға мүмкіндік береді, сондай – ақ анаэробты продуценттерді пайдалануға мүмкіндік береді.

Алдымен ферментаторды қоректік ортамен толтырады, стерильдейді, содан кейін арнайы генератордан берілетін таза дақыл себеді. Ферментерде жұқтырудың алдын алу үшін рН, температураның, тотығу-қалпына келтіру әлеуетінің оңтайлы мәндерімен және өсірудің басқа да жағдайларымен қатар жоғары қысымды ұстап тұрады. Ферменттерді алудың тереңдік тәсілінің негізгі параметрлері слайдта келтірілген.

Беттік әдіспен өсірілген микроорганизмдер дақылы және терең қопсытудан кейінгі дақылдық сұйықтықтың құрамында балласты заттардың көп мөлшері бар. Ферменттерді бөліп алу және тазалау-көп еңбекті қажет ететін және қымбат процесс, сондықтан егер ферментті препаратты микроорганизмдердің тазартылмаған дақылдары түрінде пайдалануға болатын болса, оны тазарту жүргізілмейді. Спирт және былғары сияқты салаларда микроорганизмдердің тазартылмаған дақылдарын пайдаланған жөн; сондай-ақ, жем дайындау кезінде және фермаларда жемді тікелей өңдеу кезінде ауыл шаруашылығында микроорганизмдер дақылдарын пайдалану туралы да айтуға болады.

Тамақ өнеркәсібінің көптеген салаларында (нан пісіру, сыра қайнату, шарап жасау, ірімшік жасау, крахмал-сірне және сокоэкстрактілі өндірістер), сондай-ақ микробиологиялық өнеркәсіпте және әсіресе медицинада тек қана тазартылған ферменттер препараттарын пайдалануға болады, ішінара немесе толықтай балластты заттардан босатылған.

Тазартылған ферментті препараттарды алу үшін бастапқы материал ретінде культуральды сұйықтықтың сүзгіші, азырақ – продуцент биомассасы немесе продуценттің беттік дақылынан алынған су сығындысы болуы мүмкін. Ферментті препараттар ұнтақ немесе сұйық концентраттар түрінде алынуы мүмкін. Бөліну процесінде препараттың жалпы массасындағы белсенді ақуыз үлесі артады, яғни оның меншікті белсенділігі артады.

Мысалы, кестеде Г3х техникалық препаратынан жоғары тазаланған протеиназаның бөлінуінің негізгі кезеңдері берілген. Бұл схема жоғары шығумен (22% дейін) металлопротеиназаларға қатысты в. subtilis жасушадан тыс бейтарап протеиназаның тазартылған препаратын алуға мүмкіндік береді.

Ферментті балласты заттардан тазарту схемасы оны ерімейтін заттардан, ілеспе еритін заттардан және басқа да ферменттерден босатуға жатады. Беттік және тереңдік дақылдардан тазартылған препараттарды алу процестері әртүрлі. Үстіңгі дақылдардан балласты заттардың көп болуына байланысты жоғары тазаланған препараттарды алу қиын. Тереңдік дақылдардан тазартылған препараттарды алу біршама жеңілірек, бірақ егер ферменттерді бөлу дақылдың сұйық бөлігінен жүргізілсе, сұйылтылған ерітінділерден бөліп алу керек. Егер жасушаішілік фермент болса, онда микроорганизмдердің жасушаларын бұзу қажет.

Микроағзалардың тереңдік және беттік дақылдарынан ферменттерді бөліп алу мен тазартудың принципті схемасын келесі схема түрінде ұсынуға болады.

Ол беттік дақылдардан алынған сығындының немесе культуральды сұйықтықтың сүзгіші әр түрлі дәрежедегі тазалау ферменттерінің препараттарын алу үшін бастапқы материал болып табылатыны анық. Бөлінудің бірінші кезеңінде процестің қалдығы дақылдың ерімейтін бөлігі – ортаның ерімейтін қосылыстары мен продуценттің биомассасы бар биошрот болып табылады.

Одан әрі бөлінетін ферменттің және оған ілеспе балласт заттардың қасиеттеріне байланысты тазартылған ферментті препараттарды алу кезінде термиялық фракциялау, органикалық еріткіштермен және тұздармен тұндыру, молекулалық електерде тазарту,ион алмасу хроматография, электрофорез және т. б. сияқты әртүрлі әдістер мен әдістерді біріктіреді.

Сұйық концентраттар, құрғақ техникалық препараттар және органикалық еріткіштермен тұнған препараттар түрінде беткі және тереңдік дақылдардан препараттар алудың тағы бір технологиялық схемасы.

Салқындатылған дақылдық сұйықтықтың сүзгіші негізгі жинағышта жиналады және қажеттілігіне қарай пленкалы типті вакуум-булау қондырғысының жылытқышқа түсер алдында сыйымдылығы аз жинаққа беріледі. Құрамында 6-10% құрғақ заты бар культуральды сұйықтық концентраты концентрат жинағына түседі. Құрғақ техникалық препаратты алу үшін концентратты тозаңдату кептіргішінің мұнарасына жібереді 8. 10 циклон, 11 бункер және 12 шнек арқылы құрғақ препарат стандарттау, буып-түю және буып-түю сатысына түседі.

Тазартылған препаратты алу үшін жинақтан концентрат органикалық еріткішпен тұндыруға беріледі. Алдын ала концентратты жылу алмастырғышта 2 – 3 °С температураға дейін салқындатады және дозатор арқылы тұндырғышқа береді. Тұнбаға бір мезгілде салқындатылған еріткіш мөлшерленеді. Пайда болған тұнба Сепараторда бөлінеді 16. Шөгінді сұйықтықты регенерацияға, ал тұнбаны спиртпен жууға және қайта сепарациялауға жібереді. Жуылған тұнбаны вакуумда кептіреді, ұсақтайды, өлшейді, толтырғышпен араластырады және өлшеуге және буып-түюге жібереді.Ферменттердің көздері өсімдік материалдары болып табылады-дәнді дақылдардың өсірілген дәндері (уыт); жануарлардың ағзалары мен тіндері – ұйқы безі, асқазанның шырышты қабықтары, ірі қара малдың ұлпалары; сондай – ақ микроорганизмдер-бактериялар, саңырауқұлақтар, ашытқылар, актиномицеттер.

Қазіргі жіктеме бойынша 2000-нан астам ферменттер сәйкестендірілді. Өнеркәсіптік жағдайларда 250-ге жуық ферментті препараттар өндіреді, бірақ барлық өнімнің 99% тек 18 ферментке ғана тиесілі. Әлемдік тәжірибеде ең үлкен көлемде синтетикалық жуу құралдарында кеңінен қолданылатын протеиназдар және крахмалды қайта өңдеуге арналған амилазалар өндіріледі. Олардың үлесіне ферментті препараттарды шығарудың жалпы көлемінің 65% – ға дейін келеді.

Ферменттер бірқатар салаларда қолданылады: тамақ өнеркәсібінде – сыра қайнату және шарап жасау, нан пісіру, ірімшік өндіру, шырындар мен глюкоза-фруктозалық шәрбаттар өндіру; тоқыма өнеркәсібінде; тері өнеркәсібінде – теріні құрғату және жұмсарту; медицинада – қабыну процестерін, күйіктерді, тромбоздарды емдеуде; ауыл шаруашылығында – ірі жемдерді өңдеу үшін; аналитикалық химия; органикалық синтезде; генетикалық инженерия.

Ферменттер биокатализаторлар ретінде жоғары белсенділікке және әсерінің таңдауына ие. Кейбір жағдайларда ферменттер абсолютті ерекшелігімен сипатталады. Әрбір фермент үшін рН шамасының оңтайлы аймағы бар, онда оның каталитикалық әсері барынша жоғары. Температураның жоғарылауы ферментативті реакцияны тездетеді, бірақ 40-50°С температурада көптеген ферменттер инактивацияланады (денатурацияланады).

Халықаралық практикада фермент белсенділігінің стандартты бірлігі үшін стандартты жағдайларда 1 мин ішінде 1 мкмоль субстраттың айналуын катализациялайтын фермент саны қабылданады. Стандарт талаптары бойынша белсенділікті реакцияның бастапқы жылдамдығы бойынша 30°С температурада анықтайды, реакцияның қалған шарттары әр ферментке жеке. Ферменттік препараттың белсенділігі 1 мл ферменттік ерітіндіге немесе 1 г препаратқа сәйкес келетін белсенділіктің шартты бірліктерінде көрінеді. Өндірістік практикада стандартты белсенділігі бар 1 т тауарлық препараттың шартты тоннасы түсінігін пайдаланады.

Ферменттер көзі ретінде микроорганизмдер үлкен қызығушылық тудырады, өйткені оларға биомассаның жоғары жылдамдығы кезінде ферменттік жүйелердің қызмет етуінің жоғары қарқындылығы тән. Микроорганизмдер жасушаларынан, әсіресе культуралды ортадан ферменттік препараттарды алу Өсімдік және жануарлар тіндерінен әлдеқайда үнемді. Кейбір ферменттер тек микроорганизмдерде ғана анықталған: рацемаздар; кератиназдар, гидролиздеуші белоктар-шаш, қауырсын, мүйіз және тұяқтардың құрамына кіретін кератиндер; молекулалық азотты аммиакқа дейін қалпына келтіруге қатысатын нитрогеназа және т. б. Жоғары температурада (45-80°С) өсе алатын кейбір микроорганизмдер 70°С-ден астам температурада белсенділікті сақтайтын термостабильді ферменттерді құрайды.

Көптеген микробтық ферменттер қышқыл және сілтілі ортадағы белсенділігі бойынша бірегей: қышқыл протеаздар рН 1,5-3,5 кезінде тұрақты, ал сілтілі ферменттер рН 8,0-ден жоғары белсенділік танытады. Ақыр соңында белгілі, бір реакцияны катализдейтін, бірақ әртүрлі микроорганизмдерден алынған ферменттер қасиеттері бойынша айтарлықтай ерекшеленуі мүмкін.

Микроорганизмдер әртүрлі ферменттерді синтездеуге қабілетті: амилолитикалық, протеолитикалық, пектолитикалық, целлюлолитикалық, липолитикалық және т.б. микробтық ферменттердің негізгі жеткізушілері саңырауқұлақтар (Aspergillus, Penicillium, Fusаrium, Rhizopus) болып табылады. Соңғы уақытта бактериялар (Bacillus, Escherihia), ашытқы және ашытқы тәрізді саңырауқұлақтар (Candida, Endomycopsis, Saccharomyces) ферменттері кеңінен қолданылады. Ферментті препараттарды өнеркәсіптік алу үшін табиғи штаммдар да, мутанттар да қолданылады. Микроорганизмдер қандай да бір ферменттің басым жиналуымен ферменттер кешенін синтездейді,бірақ мутантты штаммдардың арасында белгілі бір ферментті басым түрде шығаруға қабілетті “моноферментті” продуценттер бар.Ферменттердің өнеркәсіптік препараттарында балластты заттар бар және тазалықтың әр түрлі дәрежесі бар. Препараттың атауы Негізгі ферменттің қысқартылған атауынан және продуценттің түр атауынан құралады. Мысалы: протосубтилин-протеиназа негізгі ферменті, продуцент-Bacillus subtilis; глюкаваморин-глюкоамилаза, Aspergillus awamori; амилосубтилин-амилаза, Bacillus subtilis; пектофоетидин-пектиназа, Aspergillus foetidus; амилоризин-амилаза, Aspergillus oryzae. Препараттың атауында микроағзаны өсіру тәсілі (п – беттік, Г – тереңдік) және препараттың тазарту дәрежесін сипаттайтын индекс “х” (х, 2х, 3х, 10х және т.б.) әрпінің алдында сан түрінде көрсетіледі. “Х” әрпінің алдында сан неғұрлым көп болса, препаратты тазалау дәрежесі соғұрлым жоғары:

– Пх, Гх – қандай да бір тазартусыз продуценттің бастапқы дақылы;

– П2х, Г2х-бастапқы дақылдағы еритін заттардың сұйық концентраты (40-50% құрғақ зат), ерімейтін заттардан босатылған;

– П3х, Г3х-беттік дақылдар сығындысын немесе сұйық концентраттарды кептіруден алынған құрғақ ферментті препараттар П2х, Г2х;

– П10х, Г10х-органикалық еріткішпен су ерітінділерінен ферменттерді тұндыру немесе төгу арқылы алынған құрғақ препараттар;

– П20х, Г20х-жоғары тазартылған, бірақ 25% – ға дейін балластты заттар бар кристалды емес ферментті препараттар.

10х және одан жоғары индексті ферменттер препараттары тазартылған, аз индекс шасымен – техникалық препараттарға жатады.

Өндірістік жағдайларда ферменттердің продуценттері тереңдік те, беттік де әдіспен егіледі. Продуцентті өсіру тәсіліне қарамастан көптеген ферменттердің тән қасиеті олардың индуцибельділігі болып табылады. Ферменттер биосинтезінің индукторы көбінесе осы фермент әрекет ететін субстрат, сондай-ақ ішінара гидролиз өнімдері немесе субстраттың кейбір аналогтары болып табылады. Мысалы, амилаз биосинтезінің индукторы крахмал, пектиназ-пектинді заттар.

Ферменттер продуценттерін (мицелиалды саңырауқұлақтарды) беттік өсіру кюветтік әдісті пайдалануға негізделеді. Тесілген түбі бар ашық кюветтер (600 800 30 мм) стационарлық сөрелерде немесе жылжымалы этажеркаларда биіктігі екі метрге дейінгі қабаттармен орналастырылады, олар көлемі 90 м3 (3 10 м) өсімдік камерасында орналастырылады. Кептіру камерасы камераға берілетін ауа параметрлерін (температурасы мен ылғалдылығын) тұрақтандыру үшін кондиционермен жабдықталған. Ауа шығыны өсіп келе жатқан саңырауқұлақтарды оттегімен қамтамасыз ету үшін ғана емес, сонымен қатар олар бөлетін биологиялық жылуды бұру үшін де есептеледі.

Беттік өсіру кезінде ортаның негізгі компоненті саңырауқұлақтардың өсуі мен дамуы үшін барлық қажетті қоректік заттардан тұратын бидай кебегі болып табылады. Ферменттердің белсенділігін арттыру үшін қоректік ортаға әр түрлі қоспалар енгізіледі: қызылша сығындысы (пектолитикалық ферменттер синтезінің индукторы), соя ұны (протеаз индукторы), сыра ұнтағы немесе мия өсінділері (амилаз индукторы), сұлы қабығы, ағаш үгінділері (орта қопсытқыштары). Қоректік ортаны бітеу бумен жылытылатын шнекті стерилизаторда стерильдейді.

Ферменттерді өндіру үшін оңтайлы ортаның ылғалдылығы-55-70%. Шамадан тыс ылғалдандыру ортаның босаңсыған құрылымын бұзады, мәдениетке оттегінің қол жеткізуін азайтады және биосинтезді баяулатады. Ылғалдылықтың төмендігі дақылдың дау пайда болуына жылдам көшуіне ықпал етеді,бұл егіс материалын алу кезінде пайдаланылады.

Егіс материалы-қатты ортада өсірілген беткі дақылды, даулы материалды немесе терең егілген продуценттің мицелиялық массасын білдіреді. Егістік жер үсті дақылдарын 3 немесе 4 кезеңде барлық өсіп келе жатқан мөлшерде: 1,0–1,5 г стерильді кебек бар пробиркада, 100 г сол ортадағы колбаларда, 300-500 г ортадағы колбаларда (банкаларда) және себу кюветтерінде саңырауқұлақ өсіреді. Барлық кезеңдерде өсіру (28±2)°С температурада мол дау пайда болғанға дейін жүзеге асырылады. Сақтау мерзімін ұзарту үшін егіс дақылдарын 10-12% ылғалдылыққа дейін кептіру камерасында ауамен үрлеп кептіреді және 4-6°С кезінде полиэтилен пакеттерде сақтайды.

Арнайы вибросепараторда даулы материалдарды алу үшін ауа ағынымен конидияны беткі дақылдың негізгі массасынан бөледі. Мицелиалды массаны инокулятордағы сұйық ортада саңырауқұлақты өсіреді.

Осы кезеңде саңырауқұлақ өсудің үш сатысынан өтеді. Бірінші кезең (10-12 сағат) – конидиялардың ісінуі және олардың өсуі. Екінші кезең (14-18 сағат) – көп жылудың бөлінуімен қатар жүретін мицелийдің белсенді өсуі (4000 кДж/кг дақыл). Өсімдік камерасына сағат 26-28°С температурада 40-60 ауа көлемін береді. Үшінші кезең (12-18 с) ферменттердің белсенді пайда болуы және конидиялардың пайда болуы басталғанда алмасу процестерінің баяулауымен сипатталады. Ауа алмасу екінші сатымен салыстырғанда 3-5 есе азаяды. Үшінші саты аяқталғаннан кейін өсімдік камерасына температурасы 38-40°С ауа береді және 3-6 сағат ішінде 45-35% ылғалдылыққа дейін дақылдарды кептіреді, бұл оның перфорацияланған бетінен кювет бөлінуін және кейінгі өңдеуді жеңілдетеді. Өсімдік камералары келесі режим бойынша жұмыс істейді: тиеу-2 сағат, саңырауқұлақты өсіру – 22-30 сағат, дақылдарды кептіру – 3-6 сағат, түсіру – 2 сағат, камераны тазалау және жуу – 1 сағат, формалинмен, аммиакпен (формалинді жою үшін) және бумен өңдеу – 3 сағат, аэрирлеу – 3 сағат.

Беттік әдіс қол еңбегінің үлкен шығындарымен, өсімдік камераларының аз өнімділігімен, үлкен өндірістік алаңдарға қажеттілігімен ерекшеленеді. Әдістің артықшылығы-ферменттің жоғары құрамы.

Қазіргі жағдайда саңырауқұлақтарды үстіртін өсіру механикаландырылған қондырғыларда жүзеге асырылады, олардың арасында ең үлкен қызығушылық жалюзиялық тәрелкелері бар колонналық аппарат болып табылады, оларда саңырауқұлақтар қалыңдығы 300 мм дейінгі сусымалы ортаның қабатында өсіріледі.

Ферменттер продуценттерін терең қопсыту беттік алдында бірқатар артықшылықтарға ие: өндірістік алаңдарды айтарлықтай қысқартуға мүмкіндік береді, өндірістік емес қол еңбегін болдырмайды, еңбек гигиенасын жақсартады, өндірісті автоматтандыруға мүмкіндік береді. Терең қопсыту кезінде қоректік орта компоненттерін пайдалану дәрежесі жақсарады, өндіріс қалдықтарының көлемі қысқарады, ферменттердің тазартылған препараттарын алу жеңілдетіледі.

Ферментацияны қатаң асептикалық жағдайларда жүзеге асырады. Ферменттер продуценттерін терең қопсыту кезінде қоректік ортаның негізгі компоненттері картоп және жүгері крахмалы, жүгері ұны, жүгері сығындысы, макро және микроэлементтер болып табылады. Мицелиалды саңырауқұлақтар протеиназдарының түзілуін ынталандыратын маңызды микроэлементтердің бірі мырыш болып табылады. Терең қопсыту кезінде ферменттер синтезінің индуцибельділігі айқын көрінеді. Көптеген ферменттер экстрацеллюлар өнімдері болып табылады және қоршаған сұйық ортаға бөлінеді. Мицелияда әдетте барлық ферменттердің 10-15% – нан артық емес.

Ферменттердің биосинтезі үшін ортаның рН оңтайлы мәні продуценттің ерекшеліктеріне байланысты, бірақ жалпы заңдылықтар да бар. Саңырауқұлақтар мен ашытқылар жақсы өседі және рН ортасындағы 3,8–5,6 ферменттер құрайды, бактериялар РН кезінде нейтральды (6,2–7,4) жақын дамиды. Орта құрамына және рН метаболизмінің өнімдеріне байланысты ферментация кезінде төмендеуі немесе артуы мүмкін. Ферменттердің түзілу деңгейі мен жылдамдығы ферментациялық ортаның аэрация қарқындылығына байланысты. Жалпы алғанда, ортаның аэрлеу дәрежесін арттыру, әдетте, ферменттер биосинтезінің қарқындылығына және өсіру ұзақтығын қысқартуға әкеледі.